Réaction en chaîne par polymérase
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La réaction en chaîne par polymérase (ou en anglais, la polymerase chain reaction, PCR), est une méthode de biologie moléculaire mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint le prix Nobel en 1993. Cette méthode permet de dupliquer un fragment d'ADN, et par répétition du processus, d'atteindre des milliards de copies : 2 N au bout de N cycles. C'est une technique d'étude de la génétique.
Principe
La technique de la PCR est un procédé d’amplification exponentielle in vitro d’une séquence définie d’acide désoxyribonucléique (ADN) à partir d’une quantité minime de matériel génétique, grâce à une ADN polymérase. L'ADN polymérase provient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). Cette méthode permet de multiplier une séquence cible (près d’un million de copies en quelques heures). La PCR est considérée comme une révolution majeure en biologie moléculaire, notamment depuis que l’on a pu isoler initialement la Taq-polymérase.
Chaque cycle est constitué de 3 étapes s’effectuant à des températures différentes :
- Dénaturation (environ 95 ° C) : les deux brins de la molécule d'ADN sont dissociés par la chaleur
- Hybridation (entre 50 et 60°C) : hybridation de deux amorces d'ADN sur chaque région complémentaire, présente sur la matrice d’ADN cible
- Extension (environ 72°C) : synthèse des brins d'ADN à partir des amorces d’hybridation
Ce cycle de 3 étapes est répété plusieurs fois : la séquence cible est doublée à chaque cycle, d’après un taux d’amplification théorique de 2n (avec n cycles répétés).
La technique de la PCR peut être qualitative ou quantitative, donc plus précise. Dans ce dernier cas, toutes les étapes, analysées en temps réel par ordinateur, sont réalisées dans une plaque multi-puits ou dans un capillaire, placé dans un thermocycleur dont la température varie. Cet appareil permet une automatisation de la technique. Pour quantifier la réaction de PCR, il existe deux méthodes, basées sur la fluorescence :
- SYBR Green I, une molécule qui émet de la fluorescence en s’intercalant entre les bases durant la phase d’extension.
- Les sondes d’hybridation oligonucléotidiques fluorescentes de type « Quenching », avec le FRET (transfert de fluorescence) et la méthode TaqMan.
Les applications de la PCR sont nombreuses, aussi bien dans la recherche fondamentale qu’en médecine, en routine, ou dans d’autres domaines comme la criminologie et l’industrie agro-alimentaire à propos des organismes génétiquement modifiés.
