Microscope à fluorescence

Un article de Freepedia.

La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps de transférer la lumière qu'ils reçoivent en radiation lumineuse de plus grande longueur d'onde.

Depuis la découverte du phénomène au début du XX^e siècle, de nombreuses applications ont vu le jour dans des domaines variés des sciences et techniques. Ainsi la microscopie optique va permettre de déceler la présence de divers composés par l'observation de la fluorescence.

La microscopie en fluorescence fait désormais partie des méthodes de recherche utilisées en routine.

Principe de la microscopie en fluorescence

La luminescence est un procédé qui peut se scinder en 2 grandes catégories : la fluorescence et la phosphorescence.

Un objet éclairé émet de la lumière dans toutes les directions de l'espace à une longueur d'onde différente de la longueur d'onde excitatrice. Pour une substance donnée si l'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation alors on la dit fluorescente, si cette émission continue alors la substance est phosphorescente.

En fluorescence on distingue deux types d'objets : les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes, on parle de fluorescence primaire ou autofluorescence (chlorophylle, huile...), les autres doivent être combinés à une substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de fluorescence secondaire. En microscopie de fluorescence on peut visualiser des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes en les marquant avec des fluorochromes (le DAPI marque l'ADN qui fluoresce en bleu). Certains marqueurs génétiques comme la GFP (protéine fluorescente verte) sont aussi très utilisés en biologie. Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et ne nécessite pas l'ajout de substrat, la fluorescence peut alors être visualisée directement dans les cellules vivantes.

Historique de la microscopie de fluorescence

Voir aussi l'article Fluorescence pour l'historique de la fluorescence elle-même.

Différents types de microscopes

Le microscope est un outil d'observation qui a vu le jour au XIX^e siècle. Le microscope optique traditionnel, le microscope électronique à balayage, le microscope électronique à transmission, le microscope optique de fluorescence, le confocal sont maintenant utilisés en routine dans de nombreux laboratoires. Le microscope de fluorescence est construit de façon à produire un rayonnement de fluorescence et l'observer. En microscopie de fluorescence, on utilise l'informatique pour traiter les images (déconvolution).

Dans ce domaine (microscopie de fluorescence) de nombreuses techniques se sont développées.

• Le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer.
• L'immunomarquage direct ou indirect font intervenir un anticorps marqué.
• La technique du FISH sert à marquer des séquences nucléotidiques.
• La GFP consiste à intégrer dans le génome de la cellule à observer un gène de protéine fluorescente, la protéine synthétisée est alors fluorescente.
• Le FLIP et le FRAP consistent à irradier une zone dont la fluorescence va disparaître. Ces techniques permettent d'étudier les mouvements cellulaires, en effet si des molécules se déplacent la fluorescence se déplacera elle aussi.
• Le FRET utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules.
• la TIRFM Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy ou microscopy de fluorescence par réflexion totale interne

La microscopie de fluorescence a de nombreux domaines d'application.